|Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 |
|Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |
Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в
кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от
процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси
ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.
Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим
образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в
течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и
центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей
комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если
содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда
титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3
мл, то расчет вели следующим образом.
0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 %
гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки
содержится:
0,3 мл (1:10) — 1
1,0 мл — Х
Х =[pic] = 3,33 ел/мл.
2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для
определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал-
вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные
пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл
суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл
комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина
добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1
ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили
супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл
стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной
экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение
сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком
разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные
рассчитывали по формуле:
|Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 |
|полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| |
|Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |
Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в
разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,
содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:
[pic]Ч10 = 3 ед/мл.
Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую
активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и
молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,
1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М.
Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С.
Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А.
Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И.
Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В.
Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В.
Биктимиров, 1993.
При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента
крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к
исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы
других литических факторов исследуемой пробы.
При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно
осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу
крупного рогатого скота.
Для определения пропердина использовали модифицированный метод
предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.
2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для
определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови
О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический
метод.
В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной
среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и
микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой
инкубации.
Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и
выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали
стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до
содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев
на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной
температуре.
Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали
питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200
мг% амминного азота.
В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали
по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой
сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной
бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).
Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той
лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл
стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет
тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все
кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды
определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.
После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно
определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24
ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной
дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови
проводили по формуле:
А=100- [pic]Ч100,
Где: А — бактерицидная активность (в %);
Д — оптическая плотность;
Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).
Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА)
по формуле:
Средняя НБА = [pic],
Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной
сыворотки;
А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,
5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);
Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).
2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке
опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.
Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в
термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в
течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим
раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до
2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной
бане при 70° С в течение 30 мин.
Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую
культуру Е. coli.
Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные
стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного
раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно
смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного
перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин,
предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.
Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе,
нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по
Романовскому-Гимза.
Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду
усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия
(Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия
(KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды
прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен
6,813.
Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл
усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали
водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали
под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.
Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На
основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число
поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент
фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450
реакций.
2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови,
молозиве и молоке крупного рогатого скота.
Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г
натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида
натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и
доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г
однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.
Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении
обеспечивающим рН буфера 8,0.
Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной
вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения
образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20